出品 | 搜狐健康
作者 | 施桂娟
編輯 | 袁月
近期，首都醫科大學附屬北京佑安醫院任鋒教授科研團隊在國際期刊《Emerging Microbes & Infections》（IF=19.568）發表了題為“CRISPR/Cas13a-assisted Rapid and Portable HBV DNA Detection for Low-Level Viremia Patients”的學術論文，該團隊利用CRISPR/Cas13a檢測新技術，聯合等溫擴增技術（RAA），建立了基于RAA-CRISPR/ Cas13a的HBV DNA快速、便攜檢測試紙條。為乙肝病毒（HBV）感染者特別是HBV低病毒血癥患者（LLV）的HBV DNA檢測提供了一種可視化的、更快的替代方案。首都醫科大學附屬北京佑安醫院博士研究生田原、范子豪和徐玲為該研究的共同第一作者，任鋒教授、張向穎副教授和段鐘平教授為共同通訊作者。
HBV檢測的效率和覆蓋率有待提高
世界衛生組織（WHO）制定了到2030年消除HBV作為公共衛生威脅的戰略，其中主要目標之一就是提高HBV檢測的效率和覆蓋率。然而，在全世界超過2.5億HBV感染者中，95%以上的患者生活在低收入和中等收入國家，且僅有12-25%的患者符合診斷和抗HBV治療的條件。此外，經過長期規范化的一線抗病毒藥物治療后，越來越多的患者被檢測到血漿中持續或間歇性低水平的HBV DNA陽性，稱為低水平病毒血癥（LLV）。
任鋒教授科研團隊的研究旨在推動HBV感染檢測適應任何中小型實驗室或現場調查，有效的提高HBV檢測的效率和覆蓋率。
CRISPR新技術可實現病原核酸的高靈敏度檢測
成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關系統（Cas）作為一種新型的核酸檢測技術，因其具有高靈敏度和高特異性的獨特特性，在過去的十年中受到了廣泛的關注并取得了很大的進展。CRISPR新技術被《Nature》認為可能是2022年7大“顛覆性”技術之一。
2017年，《Science》報道了美國麻省理工學院張峰團隊首次將CRISPR-Cas13a檢測技術與重組酶聚合酶擴增（RPA/RAA）技術相結合，建立新的核酸檢測技術SHERLOCK，實現單拷貝、高特異性核酸檢測方法。此外，CRISPR系統可利用側流試紙條快速、便攜的特點，無需專業人員即可實現病原核酸的高靈敏度、高特異性檢測。
CRISPR新技術為HBV DNA的快速檢測提供新的平臺
目前針對HBV檢測的試紙條主要依靠血清學標志物如乙肝表面抗原（HBsAg）等，而針對HBV DNA的即時檢測（POCT）檢測仍是空白領域。CRISPR/Cas檢測——新興的核酸分子診斷技術已經滿足了試紙條的敏感性、特異性和低成本的要求，成為即時檢測(POCT)的發展趨勢。因此，側流試紙條結合CRISPR/Cas技術可為HBV DNA的快速檢測提供新的平臺。
研究利用CRISPR/Cas13a檢測新技術聯合RAA技術，建立了基于RAA-CRISPR/ Cas13a的HBV DNA的檢測方法。通過對大約10000條HBV DNA序列比對，確定保守區序列，并基于此序列構建crRNA和RAA引物，完成了高特異性crRNA和RAA引物的篩選和驗證，并對此申請了相關國家專利（202110200314.6）。其次，該方法可有效鑒定HBV DNA陽性質粒和臨床樣本，且靈敏度為101拷貝/μL，特異度為100%。同時，也對整個檢測反應進程進行了相應的條件優化。因此，該研究成功有效地建立了一個HBV DNA的CRISPR/Cas13a檢測系統。
研究將基于RAA-CRISPR/ Cas13a系統與膠體金試紙結合使用，實現了快速、便攜地HBV DNA檢測。通過不同濃度的HBV陽性質粒和不同病毒載量的臨床樣本分別對該方法進行了驗證。
CRISPR/Cas13a檢測試紙條有效性較高
為評估CRISPR/Cas13a檢測試紙條的有效性，任鋒教授科研團隊選取了HBV感染的LLV患者進行臨床驗證。通過對qPCR、CRISPR/Cas13a試紙條檢測和CRISPR/Cas13a熒光檢測三種方法的比較，CRISPR/Cas13a試紙條檢測在LLV患者HBV DNA檢測中的陽性符合率約為87%，陰性符合率為100%。
為進一步評估CRISPR/Cas13a檢測試紙條的有效性，該研究團隊還選取了慢性乙型肝炎抗病毒治療患者的動態血漿樣本（111份），以增加臨床樣本數量進行驗證。以qPCR為HBV DNA檢測的標準，CRISPR/Cas13a試紙條檢測抗病毒治療患者動態樣本中HBV DNA的靈敏度、特異度、陽性預測值（PPA）和陰性預測值（NPA）值分別為100%、92.15%、93.75%和100%。
綜上，這種快速便攜的HBV DNA檢測試紙條或其他類似檢測方法將有望迅速擴大HBV感染的診斷篩查能力和覆蓋面積，特別是LLV患者。此外，研究為目前基于PCR的HBV感染診斷提供了一種可視化和更快的替代方案。這將簡化HBV感染患者抗病毒治療效果的驗證過程，有助于解決HBV感染這一全球公共衛生問題。